【目的】研究体外诱导的大肠埃希菌耐药突变株对替加环素交叉耐药机制。【方法】采用MPC诱导方法，使用盐酸多西环素对大肠埃希菌ATCC 25922进行分步耐药突变诱导，并对诱导所得耐药突变株进行耐药谱测定；全基因组二代测序分析ATCC 25922及最高倍耐药突变株的关键差异耐药基因突变情况，根据全基因测序结果使用RT-PCR技术对最高倍耐药突变株的关键差异耐药基因进行转录量测定；采用siRNA技术分别干扰关键差异耐药基因在最高倍耐药突变株中的表达。【结果】经分步耐药突变诱导获得3株不同程度对替加环素耐药的大肠埃希菌耐药突变株，分别为Y_(3.2-2)、Y_(64)、Y_(128-2)，且耐药程度Y_(3.2-2)Y_(64)Y_(128-2)，耐药谱均表现出多重耐药性；检出14种耐药基因均出现不同程度的碱基突变和氨基酸突变；高倍耐药突变株Y_(128-2)的acrA、acrE、acrF、acrS、plsC、rpsJ、acrB和macA上调，tolC、marA、sdiA、macB下调；Y_(128-2)的rpsJ、plsC耐药基因在1×MIC和1/2×MIC替加环素浓度下成功干扰，菌株恢复对替加环素的敏感性。【结论】体外诱导所得的高倍耐药突变株Y_(128-2)对替加环素产生耐药性的主要作用机制是核糖体结合位点rpsJ和细菌细胞膜通透性相关耐药基因plsC过量表达。