柞蚕化蛹过程中柔软透明的表皮会在短时间内黑化,但在较高温度(29℃)下化蛹则形成黄体色蛹。本研究关注的N-β-丙氨酰多巴胺(NBAD)是昆虫表皮硬化和黄色化的影响因素。通过23℃(黑体色蛹)和29℃(黄体色蛹)处理我们发现NBAD合成通路中天冬氨酸脱羧酶(ADC)和NBAD合成酶(ebony)表达具有差异性。代谢组结果显示与黄色物质合成相关的β-丙氨酸和天冬氨酸在黄体色蛹中显著高表达,与体壁硬化相关的NADA在黑体色蛹中高表达。在低温条件下注射不同剂量的β-丙氨酸后形成斑驳体色或黄体色蛹。扫描电镜观察到黑体色蛹体壁更厚,横截面相对平整致密,表面突起更加明显。在29℃条件下进行RNAi,注射ds ADC和dsebony以及两者的混合后观察到刚化蛹时体色偏黑,最终形成斑驳程度不同的体色。本项研究成功地建立了适用于柞蚕的CRISPR/Cas9基因组编辑技术平台。通过显微注射的方法,将Cas9蛋白及相应的sgRNA混合注射到柞蚕胚胎中,高效介导柞蚕ApADC的敲除。结果表明突变体中ApADC的GadA结构域出现片段缺失或碱基增加,ApADC转录水平急剧下降,在29℃下化蛹形成黑色蛹。向突变体注射β-丙氨酸后,其颜色模式恢复到黄体色。以上结果表明ApADC和Apebony基因是形成黄体色蛹的重要基因,在柞蚕蛹期黑色素代谢和色素沉着模式中起着至关重要的作用。